Question

【題目】乳糖酶是一種生物酶制劑，主要用來治療乳糖不耐受癥。研究人員利用基因工程技術，將人工優(yōu)化的米曲霉乳糖酶基因（lacA）導入乳酸克魯維酵母細胞，獲得了高效表達乳糖酶的重組菌株。下圖1為載體PKLACl的限制酶切圖譜（總長度為9091bp，bp表示堿基對；XhoⅠ、BglⅡ、SacⅡ表示限制酶，數字代表堿基的編號），amdS基因編碼的乙酰胺酶能夠將乙酰胺降解成氨，只有轉化成功的乳酸克魯維酵母才能在乙酰胺作為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長。圖2為含有lacA的DNA片段。

請回答下列問題：

（1）米曲霉合成并分泌至胞外的乳糖酶能將乳糖分解為________。

（2）優(yōu)化后的米曲霉乳糖酶基因片段lacA中G-C堿基含量由原來的51.4%降低到39.2%，使乳酸克魯維酵母偏愛的密碼子出現的頻率大幅度增加，從而在不改變乳糖酶________序列的前提下，提高了重組菌株該基因表達中________（填具體步驟）的效率。

（3）將優(yōu)化的米曲霉乳糖酶基因片段lacA與pKLACl分別使用用XhoⅠ、BelⅡ雙酶切，然后用________連接,得到含目的基因的重組質粒（pKLAC1—lacA，長度為12040bp）。若目的基因置換了pKLACl中一段長33bp的片段，則目的基因的長度為________bp.

（4）用小劑量質粒提取試劑盒提取重組質粒，對所提取的重組質粒用SacⅡ單酶切后純化，純化產物用1%瓊脂凝膠進行電泳檢測。若結果如圖3中的第________（填序號）泳道所示，則說明優(yōu)化后的目的基因片段lacA成功構建在質粒pKLACl中。

（5）將重組質粒pKLACl-lacA用SacⅡ單酶切使其線性化，純化后與感受態(tài)乳酸克魯維酵母細胞混合、轉化。用________適當稀釋細胞液，均勻地涂布于________平板上進行培養(yǎng)，富集并篩選重組菌株。將篩選出的重組菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)120h，檢測________，最終獲得高效表達乳糖酶的重組菌株。

Answer 1

【答案】葡萄糖和半乳糖 氨基酸 翻譯 DNA連接酶 2982 1、3 無菌水 以乙酰胺作為唯一氮源 乳糖酶活性/活力

【解析】

基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。
（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣，將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術，個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）乳糖由葡萄糖和半乳糖組成，故乳糖酶能將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。

（2）乳糖酶的化學本質是蛋白質，優(yōu)化后的米曲霉乳糖酶基因片段lacA中G-C堿基含量由原來的51.4%降低到39.2%，使乳酸克魯維酵母偏愛的密碼子出現的頻率大幅度增加，從而在不改變乳糖酶氨基酸序列的前提下，提高了重組菌株該基因表達中翻譯的效率。

（3）乳糖酶基因片段lacA與pKLACl分別使用XhoⅠ、BelⅡ限制性酶酶切，然后用DNA連接酶連接，得到含目的基因的重組質粒。題干信息可知，載體PKLACl的限制酶切圖譜總長度為9091bp，含目的基因的重組質粒（pKLAC1—lacA，長度為12040bp）。若目的基因置換了pKLACl中一段長33bp的片段，則目的基因的長度為12040909133=2982bp。

（4）重組質粒，用SacⅡ單酶切后，形成兩個大小不同的DNA片段，結合圖3，M是marker組，1、2、3號是酶切組，對比分析結果第1、3泳道所示，說明優(yōu)化后的目的基因片段lacA成功構建在質粒pKLACl中。

（5）防止污染用無菌水適當稀釋細胞液，均勻地涂布于以乙酰胺作為唯一氮源平板上進行培養(yǎng)，富集并篩選重組菌株。將篩選出的重組菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)120h，檢測乳糖酶活性/活力，最終獲得高效表達乳糖酶的重組菌株。