Question

【題目】下表是幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖 1、圖 2 中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

(1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用____________________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過(guò)______________酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入經(jīng)____________處理過(guò)的_____________態(tài)的大腸桿菌中。

(2)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加________________________。平板上長(zhǎng)出的菌落，常用 PCR 鑒定，所用的引物組成為圖2中的_____________。

(3)若BamH I 酶切的 DNA 末端與 Bcl I 酶切的 DNA 末端連接，連接部位的 6 個(gè)堿基對(duì)序列為______________________，對(duì)于該部位，這兩種酶__________（填“都能”、 “都不能”或“只有一種能”）切開(kāi)。

(4)若用 Sau3A I 切圖 1 質(zhì)粒最多可能獲得________________種大小不同的 DNA 片段。

(5)圖1中啟動(dòng)子的作用是__________________________________________________________。

(6)將目的基因?qū)�入棉花�?xì)胞，培育抗蟲(chóng)棉的過(guò)程涉及到哪些技術(shù)：_______________________________

Answer 1

【答案】Bcl I和Hand IIIDNA連接Ca+感受四環(huán)素引物甲和引物丙都不能7為RNA聚合酶提供識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄基因工程技術(shù)(轉(zhuǎn)基因技術(shù))和植物組織培養(yǎng)技術(shù)

【解析】

分析圖1：外源DNA上含有限制酶BclI、BamHⅠ、HindIII和Sau3AI的切割位點(diǎn)，其中限制酶BclI、BamHⅠ、HindIII的識(shí)別序列都能被Sau3kI識(shí)別。分析圖2：質(zhì)粒上有限制酶BclI、BamHⅠ、HindIII三種限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，其中BamHⅠ的切割位點(diǎn)位于兩種抗生素抗性基因上，而抗性基因?yàn)檩d體的標(biāo)記基因，因此不可用該酶切割。在目的基因上，BclⅠ、BamHI、HindⅢ和Sau3AⅠ四種酶也存在酶切位點(diǎn)。

（1）選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩端存在識(shí)別位點(diǎn)，但BamHⅠ可能使質(zhì)粒中的啟動(dòng)子丟失，且會(huì)破壞質(zhì)粒中的兩個(gè)抗性基因；Sau3AI在質(zhì)粒上有三個(gè)酶切位點(diǎn)，也會(huì)破壞質(zhì)粒中的兩個(gè)抗性基因，不利于后期的篩選，所以應(yīng)選用限制酶為BclⅠ和Hind Ⅲ。選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩側(cè)切割，切割后的DNA片段用DNA連接酶連接。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入經(jīng)鈣離子處理過(guò)的感受態(tài)的大腸桿菌中。

（2）由上一問(wèn)的討論可知，重組質(zhì)粒的氨芐青霉素抗性基因已經(jīng)破壞，僅保留了四環(huán)素抗性基因，為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素。平板上長(zhǎng)出的菌落，常用PCR鑒定，目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物需要與單鏈兩端相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合，故所用引物組成是圖2中的引物甲和引物丙。

（3）若BamHⅠ酶切的DNA末端和BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為，由于兩種酶均不能識(shí)別該部位的堿基對(duì)序列，所用兩種酶都不能切開(kāi)該部位。

（4）根據(jù)BclI、BamHⅠ和Sau3AⅠ的酶切位點(diǎn)，Sau3AⅠ在質(zhì)粒上有三個(gè)酶切位點(diǎn)，完全酶切可得到記為A、B、C三種片段，若部分位點(diǎn)被切開(kāi)，可得到AB、AC、BC、ABC四種片段，所以用Sau3AⅠ切質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。

（5）啟動(dòng)子的作用是為RNA聚合酶提供識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

（6）將目的基因?qū)�入棉花�?xì)胞，需要基因工程技術(shù)(轉(zhuǎn)基因技術(shù))；將得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培育成抗蟲(chóng)棉植株的過(guò)程涉及到植物組織培養(yǎng)技術(shù)。