Question

【題目】研究發(fā)現(xiàn)，PVY－CP基因位于某種環(huán)狀 DNA 分子中。將 PVY－CP 基因?qū)�入馬鈴薯， 使之表達(dá)即可獲得抗 PVY 病毒的馬鈴薯。 圖表示 PVY－CP 重組質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程，相關(guān)酶切位點(diǎn)如下表。

（1）步驟②選用的 klenow 酶與細(xì)胞內(nèi)的__（填酶的名稱(chēng)）的功能相似。步驟④應(yīng)選用的限制性核酸內(nèi)切酶是__________。

（2）若 BamHⅠ酶切的 DNA 末端與 BglⅡ酶切的 DNA 末端連接，連接部位的 6 個(gè)堿基對(duì)序列為_________，對(duì)于該部位，這兩種酶_________（填“都能”、“都不能”或“只有一種能”）切開(kāi)。

（3）若用 Sau3AⅠ切圖中所示的質(zhì)粒（多個(gè)），最多可能獲得_____________種大小不同的 DNA 片段。

（4）步驟⑤獲得的重組質(zhì)粒通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入馬鈴薯的原生質(zhì)體，并誘導(dǎo)形成細(xì)胞壁，再轉(zhuǎn)入_________（ A、細(xì)胞分裂素多，生長(zhǎng)素少 B、細(xì)胞分裂素少，生長(zhǎng)素多 C、細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素比例適合 D、細(xì)胞分裂素中等，生長(zhǎng)素少）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成__，再進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。

（5）可用__的方法，從個(gè)體水平檢測(cè)馬鈴薯植株中 PVY－CP 基因是否成功表達(dá)。

Answer 1

【答案】DNA聚合酶 BglⅡ和SmaⅠ 都不能 7 A 叢狀苗 PVY病毒感染

【解析】

基因工程的操作步驟：獲取目的基因（基因文庫(kù)、PCR、人工合成）；構(gòu)建基因表達(dá)載體（含標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、目的基因、復(fù)制原點(diǎn)等）；把目的基因?qū)�入受體細(xì)胞（顯微注射法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、鈣離子處理法）；目的基因的檢測(cè)和鑒定（分子水平和個(gè)體水平檢測(cè)，前者包括DNA分子雜交、分子雜交和抗原抗體雜交；后者如抗蟲(chóng)抗病接種實(shí)驗(yàn)）。

（1）步驟②選用的 klenow 酶可以催化脫氧核苷酸結(jié)合形成磷酸二酯鍵，類(lèi)似于細(xì)胞內(nèi)DNA聚合酶。經(jīng)步驟③處理后，目的基因一端的黏性末端為-GATC，一端為平末端，故選擇限制酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行切割時(shí)，應(yīng)該選擇SmaⅠ產(chǎn)生平末端，另外需要選擇一種可以產(chǎn)生-GATC黏性末端的限制酶進(jìn)行切割，結(jié)合轉(zhuǎn)錄的方向可知，應(yīng)該選擇BglⅡ，故需要選擇BglⅡ和SmaⅠ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行切割。

（2）BamHⅠ識(shí)別的序列為GGATCC，BglⅡ識(shí)別序列為AGATCT，二者切割的末端均為-GATC，二者產(chǎn)生的黏性末端經(jīng)DNA連接酶處理后，連接的產(chǎn)物為。

兩種酶均不能識(shí)別重新連接的產(chǎn)物，故均不能對(duì)其進(jìn)行切割。

（3）Sau3AⅠ的識(shí)別序列為GATC，圖中質(zhì)粒含有3個(gè)Sau3AⅠ的識(shí)別位點(diǎn)，用其進(jìn)行切割可能打開(kāi)1個(gè)切口、2個(gè)切口或3個(gè)切口，計(jì)算可知，Sau3AⅠ切割后最多可能獲得7種大小不同的 DNA 片段。

（4）步驟⑤獲得的重組質(zhì)粒通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入馬鈴薯的原生質(zhì)體，并誘導(dǎo)形成細(xì)胞壁，需要進(jìn)行組織培養(yǎng)，先轉(zhuǎn)入A、細(xì)胞分裂素（利于芽的形成）多，生長(zhǎng)素少的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成叢狀苗，再進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。

（5）可用PVY病毒感染馬鈴薯，觀察馬鈴薯是否患病，從個(gè)體水平檢測(cè)馬鈴薯植株中 PVY－CP 基因是否成功表達(dá)。