Question

【題目】PCR擴(kuò)增過(guò)程示意圖如下，核心要素包括引物設(shè)計(jì)、溫度控制和模板DNA的獲得。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）欲構(gòu)建抗利尿激素的cDNA文庫(kù)，應(yīng)從________(組織)中提取________，通過(guò)________獲得cDNA用于PCR擴(kuò)增。

（2）設(shè)計(jì)一對(duì)與抗利尿激素基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物時(shí)(引物1和引物2)，一般在引物的________端需要增加適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钗稽c(diǎn)，其目的是____________________________。

（3）PCR設(shè)計(jì)的引物序列一般介于20～30 bp，若引物序列太長(zhǎng)帶來(lái)的影響主要是______________________________________。

（4）PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度的設(shè)定主要與________________有關(guān)。

（5）如果模板DNA完全正常，但PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，其原因可能為____________、____________。

Answer 1

【答案】下丘腦 總mRNA 逆轉(zhuǎn)錄 5′ 便于酶切后構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒） PCR特異性提高，但是引物與模板鏈的結(jié)合效率降低 引物長(zhǎng)度、堿基組成 退火溫度太高 引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤

【解析】

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因：PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，原理：DNA雙鏈復(fù)制；過(guò)程：第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈（變性）；第二步：冷卻到55～60℃，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈（退火）；第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成（延伸）；擴(kuò)增目的基因的前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。

（1）下丘腦分泌抗利尿激素，所以欲構(gòu)建抗利尿激素的cDNA文庫(kù)，應(yīng)從下丘腦中提取總mRNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄等過(guò)程獲得cDNA用于PCR擴(kuò)增。這里提取mRNA是無(wú)法選擇的，只能將所有mRNA均提取出來(lái)，在PCR時(shí)可以通過(guò)設(shè)計(jì)特異性的引物來(lái)達(dá)到PCR擴(kuò)增某基因的目的。

（2）PCR是基因工程的第一步，為了后續(xù)構(gòu)建基因表達(dá)載體，在設(shè)計(jì)一對(duì)與抗利尿激素基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物時(shí)（引物1和引物2），一般在引物的5′端需要增加適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钗稽c(diǎn)。

（3）PCR設(shè)計(jì)的引物序列一般介于20～30bp，若引物序列太長(zhǎng)帶來(lái)的影響主要是擴(kuò)增效率降低，而引物太短又容易導(dǎo)致異常DNA的產(chǎn)生。

（4）PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度的設(shè)定主要與引物長(zhǎng)度和堿基組成中G-C比例呈正相關(guān)。

（5）如果退火溫度太高，引物無(wú)法與模版鏈結(jié)合，所以如果模板DNA完全正常，但PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，其原因可能為退火溫度太高或引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤（無(wú)法與任何模板鏈結(jié)合，無(wú)法進(jìn)行DNA復(fù)制）