Question

【題目】pBV220載體是我國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所自行構(gòu)建并廣泛應(yīng)用的大腸桿菌溫控載體，大小為3 666 bp（bp表示堿基對），其結(jié)構(gòu)如下圖所示。圖中PRPL是啟動子，rrB是基因轉(zhuǎn)錄終止信號，Ampr是氨芐抗性基因，ori是質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)，EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ等為各種限制性內(nèi)切酶。請據(jù)圖回答下列有關(guān)問題：

（1）基因工程的核心步驟是____________________________________。

（2）從圖中可看出，pBV220作為運(yùn)載體具備的條件有_______________、____________。

（3）該質(zhì)�？杀�A、B、C三種限制性內(nèi)切酶同時(shí)切割。單獨(dú)A切割得一條長鏈，單獨(dú)B切也得一條長鏈，A和C同時(shí)切割得2個500 bp和1個2 666 bp片段，B和C同時(shí)切割得2個250 bp和1個3 166 bp片段。若以A的切割位點(diǎn)為計(jì)算起點(diǎn)，則B的切割位點(diǎn)與A點(diǎn)最短長度為________，C的兩個切割位點(diǎn)與A點(diǎn)的最短距離分別為________、________

（4）PR和PL都是啟動子，pBV220載體構(gòu)建過程中把兩個啟動子串聯(lián)在一起，形成了雙啟動子，雙啟動子的作用可能是_________________________。溫控基因CIts857編碼對溫度敏感的CIts蛋白，CIts在30℃時(shí)具有抑制啟動子的活性，在42℃時(shí)失活。促進(jìn)工程菌目的基因表達(dá)的誘導(dǎo)溫度為________。

Answer 1

【答案】構(gòu)建目的基因的表達(dá)載體 多個限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn) 標(biāo)記基因 750 bp 500 bp 1 000 bp 保證目的基因的高水平表達(dá)（高效轉(zhuǎn)錄） 42℃

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

1、目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。

3、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

4、目的基因的檢測與鑒定：

（1）分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。

（2）個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

（1）基因工程的核心步驟是構(gòu)建目的基因的表達(dá)載體。

（2）從圖中可看出，pBV220作為運(yùn)載體具備的條件有具有多個限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)（便于目的基因的插入）、標(biāo)記基因（便于鑒定和篩選含有目的基因的受體細(xì)胞）。

（3）單獨(dú)A切割得一條長鏈，單獨(dú)B切也得一條長鏈，A和C同時(shí)切割得2個500bp和1個2666bp片段，B和C同時(shí)切割得2個250bp和1個3166bp片段，這說明該質(zhì)粒上有一個A酶切割位點(diǎn)、一個B酶切割位點(diǎn)、2個C酶切割位點(diǎn)。A和C同時(shí)切割得2個500bp和1個2666bp片段，說明A和C酶的一個切點(diǎn)之間的長度為500bp，B和C同時(shí)切割得2個250bp和1個3166bp片段，說明B和C酶的一個切點(diǎn)之間的長度為250bp，若以A的切割位點(diǎn)為計(jì)算起點(diǎn)，則B的切割位點(diǎn)與A點(diǎn)最短長度為500+250=750bp，C的兩個切割位點(diǎn)與A點(diǎn)的最短距離分別為500bp、1000bp。

（4）PR和PL都是啟動子，pBV220載體構(gòu)建過程中把兩個啟動子串聯(lián)在一起，形成了雙啟動子，雙啟動子的作用可能是保證目的基因的高水平表達(dá)（高效轉(zhuǎn)錄）．溫控基因CIts857編碼對溫度敏感的CIts蛋白，CIts在30℃時(shí)具有抑制啟動子的活性，在42℃時(shí)失活，因此要促進(jìn)工程菌目的基因表達(dá)就要使CIts蛋白失活，即促進(jìn)工程菌目的基因表達(dá)的誘導(dǎo)溫度為42℃。